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本發(fā)明適用于分子定位技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種三維納米分辨定位方法，包括：對物品中的目標分子進行熒光激發(fā)；采用兩個并行的探測通道進行熒光探測，在每個探測通道中，使熒光依次通過一物鏡及一彎曲光柵采用兩個并行的探測通道進行熒光探測，在每個探測通道中，使熒光依次通過一物鏡及一彎曲光柵，成像于同一個探測器上的不同區(qū)域或分別成像于不同的探測器上；兩個探測通道對應的成像面對應于物品中的共軛面錯位分布，間距為1～3μm；采用雙焦面法對圖像進行分析，確定目標分子的三維定位信息。本發(fā)明將彎曲光柵多焦面并行成像與雙焦面定位法有機結(jié)合，在突破現(xiàn)有顯微系統(tǒng)景深的同時，實現(xiàn)對細胞厚度范圍內(nèi)運動分子的三維納米定位和追蹤。

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